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黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測卡性能評價(jià)

時(shí)間：2016-07-22來源：飛測生物點(diǎn)擊量：

      摘要：對上海飛測生物科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條在糧食谷物飼料中的檢測性能進(jìn)行了評估。該產(chǎn)品的最低檢出限（LOD）為0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)為0.91μg/kg，線性范圍為1.00-50.00μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.89%~121.07%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%。該產(chǎn)品具有操作簡便、靈敏準(zhǔn)確、快速定量、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合用于對糧食谷物飼料中黃曲霉毒素B1的進(jìn)行快速定量測定。

      關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1檢測試紙條；熒光定量免疫層析；黃曲霉毒素B1；糧食谷物飼料

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1簡寫為AFB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?/span>，具有強(qiáng)致癌性以及劇毒性，是迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定的一種。從1993年開始黃曲霉毒素被認(rèn)定為世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定的一類致癌物，是世界公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物質(zhì)之一，而黃曲霉毒素B1由于毒性最大，污染最重，是危害最大的一種黃曲霉毒素。

黃曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴(yán)重。目前，GB 2761-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中對糧食谷物及其制品中黃曲霉毒素B1的最高限量為20μg/kg。GB13078-2001《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中對不同種類的飼料中黃曲霉毒素B1的最高限量標(biāo)準(zhǔn)從10-50μg/kg。

目前，國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1采用HPLC法，需要大型的儀器設(shè)備，價(jià)格昂貴，操作過程復(fù)雜、時(shí)間較長，且無法在現(xiàn)場和基礎(chǔ)小型實(shí)驗(yàn)室使用。除此之外，也有采用黃曲霉毒素酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙條用于大量樣品的篩查，操作簡便，檢測快速，成本也較低，但準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，容易造成假陽性或者假陰性。因此，急需一種既簡便快速，又能準(zhǔn)確定量的檢測方法，熒光定量免疫層析正好可以滿足這種需求。本文通過對多種糧食谷物飼料樣品的實(shí)測，驗(yàn)證了上海飛測生物開發(fā)的黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙條的技術(shù)性能。

1實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1試劑和材料

除注明外，均為分析純，試驗(yàn)用水均為UP水。

黃曲霉毒素B1熒光熒光定量檢測試紙條（由包被有熒光微球標(biāo)記黃曲霉毒素B1抗體的乳膠墊、噴涂有黃曲霉毒素B1抗原的檢測線和噴涂有羊抗雞二抗的控制線的NC膜、樣品墊及吸收墊組成）、樣品提取液、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)曲線ID卡及標(biāo)準(zhǔn)曲線條形碼均由上海飛測生物科技有限公司提供。

黃曲霉毒素B1及其他真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品：購自Sigma公司；

大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購得或從企業(yè)取樣。

麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠和企業(yè)取樣。

1.2儀器與設(shè)備

FD-100型熒光免疫定量分析儀和FD-5000型試紙條恒溫孵育器，上海飛測生物科技有限公司提供；低速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平：Sartorius；

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樣品的前處理

取具有代表性的待測樣品500g，用小型粉碎機(jī)粉碎1min后過20目篩，收集過篩的細(xì)小樣品。稱取1.0±0.02g過篩的樣品于10mL離心管中，加入5mL提取液，用漩渦混勻儀震蕩5min(或者搖床振蕩10min）后，4000RPM離心1min，取上清。

1.3.2檢測過程

取50μL離心上清液加入500μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3-5s，然后取100μL加入到黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中溫育10min后，將試紙條插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)，即為樣品的實(shí)際檢測濃度。當(dāng)檢測值大于50μg/kg時(shí)，可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再進(jìn)行檢測，所得讀數(shù)值乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗(yàn)結(jié)果。

2檢測結(jié)果分析

2.1線性范圍與檢出限

在樣品提取液中，分別添加1.00μg/kg、2.50μg/kg、5.00μg/kg、10.00μg/kg、25.00μg/kg、50.00μg/kg 的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，用上海飛測生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條每個(gè)樣品檢測3次，以添加濃度為為縱坐標(biāo)，以熒光定量檢測試紙條的檢測結(jié)果為橫坐標(biāo)，擬合曲線并計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如下：

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品添加與熒光定量試紙條檢測值的線性關(guān)系

計(jì)算得出小麥的線性范圍：1.00～50.00μg/kg（6點(diǎn)）， 回歸方程: y = 1.042x + 0.540,相關(guān)系數(shù)R2 = 0.998；（見圖1）。

取10個(gè)無污染（陰性）小麥樣品、10個(gè)無污染（陰性）玉米樣品和10個(gè)無污染（陰性）大米樣品，用上海飛測生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條每個(gè)樣品檢測3次，檢測限（LOD）為測定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，定量限(LOQ)為測定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。測試結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的LOD為0.29μg/kg，LOQ為0.91μg/kg。

2.2準(zhǔn)確性和重復(fù)性分析

在用國標(biāo)法測定為0的不同種類空白樣品中分別添加黃曲霉毒素B1濃度為1.00，2.50，5.00，10.00，25.00，50.00μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的檢測方法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果見表1。 

表1  不同樣本檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性

樣品

黃曲霉毒素B1添加量（μg/kg）

平行實(shí)驗(yàn)

1.00

2.50

5.00

10.00

25.00

50.00

大米

1

1.23

2.21

5.04

11.91

22.86

48.89

2

1.17

2.67

4.96

9.78

25.12

49.99

3

0.99

2.86

4.72

9.89

24.37

46.72

平均值（μg/kg）

1.13

2.58

4.91

10.53

24.12

48.53

平均回收率

112.83%

103.20%

98.14%

105.27%

96.47%

97.07%

變異系數(shù)CV

10.96%

12.95%

3.34%

11.37%

4.77%

3.42%

玉米

1

0.987

2.38

4.383

9.876

25.098

54.987

2

1.09

2.89

4.98

11.287

26.341

57.01

3

0.931

2.87

4.57

10.659

28.497

55.698

平均值（μg/kg）

1.00

2.71

4.64

10.61

26.65

55.90

平均回收率

100.27%

108.53%

92.89%

106.07%

106.58%

111.80%

變異系數(shù)CV

8.04%

10.65%

6.57%

6.66%

6.45%

1.84%

小麥

1

1.345

2.84

5.004

9.884

23.78

47.123

2

1.276

2.65

5.418

11.583

22.461

49.045

3

1.011

2.31

4.88

10.72

24.189

49.276

平均值（μg/kg）

1.21

2.60

5.10

10.73

23.48

48.48

平均回收率

121.07%

104.00%

102.01%

107.29%

93.91%

96.96%

變異系數(shù)CV

14.56%

10.33%

5.52%

7.92%

3.85%

2.44%

從表1可以看出，上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條測試不同糧食谷物中黃曲霉毒素B1的添加回收率在92.89%~121.07%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。
2.3與色譜方法的對比試驗(yàn)結(jié)果

取大米、小麥、玉米、高粱、花生、麩皮、噴漿玉米、DDGS、豆粕受污染樣品各1份，先采用國標(biāo)液相色譜法進(jìn)行測定，再使用上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條進(jìn)行測定，各測試3個(gè)平行樣。檢測結(jié)果如下： 

表3  黃曲霉毒素B1熒光定量檢測卡與高效液相色譜法檢測值對比

樣本

大米

小麥

玉米

高粱

花生

麩皮

噴漿玉米

DDGS

豆粕

色譜值

9.87

3.98

16.38

7.73

45.87

27.21

34.62

14.87

2.75

飛測生物值

1

10.73

4.52

17.83

6.76

44.54

30.13

32.87

12.73

2.32

2

9.54

4.66

18.54

6.9

47.81

28.76

31.96

13.39

2.81

3

9.42

4.27

15.99

7.51

49.82

26.52

33.63

13.98

2.42

平均值

9.90

4.48

17.45

7.06

47.39

28.47

32.82

13.37

2.52

符合度

100.27%

112.65%

106.55%

91.29%

103.31%

104.63%

94.80%

89.89%

91.52

CV

7.32%

4.41%

7.54%

5.65%

5.62%

6.40%

2.55%

4.68%

10.29%

表2表明，在不同的糧食谷物飼料中，上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條與液相色譜法的符合率為89.89%~112.65%，3次重復(fù)測定的的CV值在10.29%以內(nèi)。

2.4方法特異性

選擇其他5種常見的真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品在陰性玉米中進(jìn)行添加，添加的濃度為100 μg/kg，然后用飛測生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條進(jìn)行測試，每個(gè)樣品測3次取平均值；結(jié)果顯示與赭曲霉毒素A，伏馬菌素B1，嘔吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反應(yīng)率均＜5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1膠體金試劑條對伏馬毒素、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、玉米赤霉毒素幾乎無交叉反應(yīng)，其方法特異性可以能滿足檢測要求。

表3 交叉反應(yīng)率表

序號

名稱

測定值

交叉反應(yīng)率

1

黃曲霉毒素B1（DON）

105

100.00%

2

赭曲霉毒素A (OTA)

2.32

2.32%

3

伏馬菌素B1（FB1）

3.76

3.76%

4

黃曲霉毒素B1(AFB1)

2.68

2.68%

5

玉米赤霉烯酮(ZEN)

2.71

2.71%

6

T-2毒素(T-2)

1.33

1.33%

 

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條對不同的糧食谷物飼料樣本進(jìn)行測試，該產(chǎn)品的最低檢出限（LOD）為0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)為0.91μg/kg，線性范圍為1.00-50.00μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.89%~121.07%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%。其準(zhǔn)確性和可靠性均可以滿足歐盟和我國對黃曲霉毒素B1的分析標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求。該方法具有簡便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于不同糧食谷物飼料中黃曲霉毒素B1的快速定量檢測分析。

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